Formoterol a miogeneza – wpływ na regenerację mięśni szkieletowych

Jak formoterol wpływa na miogenezę i regenerację mięśni?

Formoterol wpływa na ekspresję miR-206 i czynników regulujących miogenezę w ludzkich komórkach mięśni szkieletowych. Badanie przeprowadzone z wykorzystaniem modelu in vitro ludzkiej miogenezy rzuca nowe światło na molekularne mechanizmy działania tego mimetyku ćwiczeń fizycznych, co może mieć istotne implikacje kliniczne w terapii schorzeń mięśniowych.

Mięśnie szkieletowe wykazują niezwykłą plastyczność w odpowiedzi na bodźce molekularne i metaboliczne. Kluczowym elementem tej plastyczności jest zdolność do regeneracji, która zachodzi przy udziale miogennych komórek satelitarnych. Komórki te nie tylko uczestniczą w regeneracji, ale również przyczyniają się do wzrostu mięśni szkieletowych poprzez zwiększanie zawartości jąder komórkowych w odpowiedzi na bodźce anaboliczne. Regulacja molekularna komórek satelitarnych jest wieloaspektowa, ale w dużej mierze kontrolowana przez serię czynników transkrypcyjnych, określanych jako czynniki regulujące miogenezę (MRF). Początkowo MRF promują aktywację i proliferację komórek satelitarnych w komórki prekursorowe (mioblasty), a następnie regulują różnicowanie i dojrzewanie tych mioblastów w dojrzałe miotuby. Ten proces, nazywany miogenezą, obejmuje rolę komórek satelitarnych w regeneracji i wzroście mięśni szkieletowych.

Oprócz MRF, miogeneza jest częściowo regulowana przez mikroRNA (miRNA lub miR), które są głównie zlokalizowane w mięśniach szkieletowych (myomiR). Rodzina myomiR, obejmująca miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-486, miR-499, miR-206, miR-208a i miR-208b, wpływa na miogenezę poprzez interakcję z MRF, w tym z czynnikiem różnicowania miogennego 1 (MyoD) i miogeniną (MyoG). W środkowej fazie miogenezy, miR-206 i miR-486 odgrywają ważną rolę w promowaniu różnicowania mioblastów, oba wydają się celować i hamować Pax7, główny regulator rozwoju mioblastów podczas wczesnej fazy miogenezy. Poza miogenezą, rodzina myomiR wpływa również na szlaki sygnalizacji komórkowej zaangażowane w regulację wzrostu mięśni szkieletowych. miR-206 i miR-486 przyczyniają się do tego procesu, wpływając na Akt – miR-206 bezpośrednio hamuje Akt, podczas gdy miR-486 pośrednio promuje ekspresję Akt, jednocześnie hamując ekspresję Foxo1.

Ćwiczenia, szczególnie trening oporowy, są silnym stymulatorem zarówno miogenezy, jak i wzrostu mięśni szkieletowych. Co istotne, myomiRs, pośredniczące w tych procesach mięśniowych, reagują zarówno na ostre, jak i przewlekłe ćwiczenia. Pomimo tego, nasze zrozumienie, jak myomiRs wpływają na funkcję i fizjologię mięśni szkieletowych na poziomie molekularnym, szczególnie w odpowiedzi na ćwiczenia, jest wciąż określane.

Czy formoterol modyfikuje ekspresję kluczowych genów miogenicznych?

W omawianym badaniu wykorzystano model in vitro ludzkich komórek mięśni szkieletowych, aby określić wpływ formoterolu – agonisty receptora β2-adrenergicznego stosowanego jako mimetyk ćwiczeń – na ekspresję miRNA, MRF i białek zaangażowanych w regulację wzrostu i funkcji mięśni szkieletowych. Wyniki podzielono na kategorie genów związanych z: (a) miogenezą, (b) wzrostem mięśni szkieletowych, (c) biogenezą komórek i mitochondriów, (d) miRNA.

Badanie wykazało, że formoterol stymuluje ekspresję genów czynników regulujących miogenezę. W dniu 6 ekspresja Myf5 wzrosła w odpowiedzi na ostrą stymulację formoterolem (D6 FORM). Nie zaobserwowano innych zmian w ekspresji Myf5 w odpowiedzi na dwa (D7 FORM) lub trzy kolejne dni (D8 FORM) stymulacji formoterolem. W dniu 8 ekspresja MyoD zmniejszyła się dla D8 FORM i D8 CON w porównaniu do D6CON. Ekspresja Pax7 zmniejszyła się w odpowiedzi zarówno na ostrą (D6 FORM), jak i kolejne dni (D7 FORM i D8 FORM) stymulacji formoterolem w porównaniu do D6 CON.

Formoterol wpływa również na ekspresję regulatorów masy mięśni szkieletowych. Ekspresja mTOR zmniejszyła się po ostrej (D6 FORM) i kolejnych dniach (D8 FORM) stymulacji formoterolem w porównaniu do D6 CON. Ekspresja MuRF1 zmniejszyła się w odpowiedzi na dwa kolejne dni (D7 FORM) stymulacji formoterolem w porównaniu do D6 CON. Nie zaobserwowano zmian w ekspresji MAFbx.

Ekspresja PGC-1α, uważanego za główny regulator biogenezy mitochondrialnej, wzrosła w odpowiedzi na ostrą stymulację formoterolem (D6 FORM) w porównaniu do wszystkich innych warunków. Nie zaobserwowano zmian w ekspresji receptora beta-2 adrenergicznego (B2AR).

Ze względu na ich funkcje regulacyjne w miogenezie i wzroście mięśni szkieletowych, zmierzono ekspresję genów miR-206 i miR-486. Ekspresja miR-206 wzrosła w odpowiedzi na kolejne dni stymulacji formoterolem (D8 FORM) w porównaniu do D6 CON, D7 CON i D6 FORM. Nie zaobserwowano zmian w ekspresji miR-486.

Analizując uzyskane wyniki, można zaobserwować, że ekspresja MRF różniła się w odpowiedzi na ostrą i kolejne dni stymulacji formoterolem. Ekspresja Myf5, czynnika MRF zaangażowanego głównie podczas wczesnej do środkowej fazy miogenezy, wzrosła w D6 FORM. Ekspresja Myf5 wzrosła również w D7 FORM i D8 FORM, jednak żadna z nich nie osiągnęła istotności statystycznej. Co istotne, wyniki dla Myf5 odzwierciedlają wcześniejsze obserwacje z laboratorium, w których ekspresja Myf5 osiągnęła szczyt w odpowiedzi na stymulację formoterolem w dniu 6 różnicowania. W porównaniu do Myf5, ekspresja MyoD i Miogeniny zmniejszyła się w odpowiedzi na ostrą stymulację formoterolem, a ekspresja ta dalej zmniejszała się w kolejnych dniach stymulacji formoterolem.

Rozważając ekspresję Myf5, MyoD i Miogeniny w obecnym badaniu, pojawia się wzorzec, w którym ekspresja wszystkich trzech MRF w D6 FORM jest zauważalnie podwyższona w porównaniu do D7 FORM i D8 FORM. Początkowo wydaje się, że kolejne dni stymulacji formoterolem mogą mieć szkodliwy wpływ na ekspresję MRF po dniu 6. Jednak zaobserwowano podobne trendy dla Myf5, MyoD i Miogeniny w D7 CON i D8 CON, co sugeruje, że po dniu 6 różnicowania aktywność miogenna mięśni szkieletowych może być zmniejszona. Mimo to, wzrost ekspresji Myf5 w D6 FORM sugeruje, że formoterol może promować proces miogeniczny. Ponieważ ekspresja Myf5 jest zwykle najwyższa podczas wczesnej do środkowej miogenezy, spekulujemy, że gdyby eksperymenty były przeprowadzane przez dłuższy okres (godziny/dni po stymulacji formoterolem), mogłyby wystąpić dodatkowe zmiany w ekspresji MyoD i Miogeniny.

Wtórnie do efektów stymulujących formoterolu, ekspresja myomiR, szczególnie miR-206, mogła potencjalnie wpłynąć na obserwacje dotyczące Myf5 w odpowiedzi na kolejne dni stymulacji formoterolem. miR-206 promuje miogenezę poprzez hamowanie kilku celów (Pax7, HDAC4) podczas wczesnej do środkowej miogenezy. W badaniu stwierdzono, że ekspresja miR-206 wzrosła w kolejnych dniach stymulacji formoterolem, a jej ekspresja była znacznie podwyższona w D8 FORM. Ten wzrost ekspresji miR-206 w D8 FORM występuje jednocześnie ze zwiększoną ekspresją Myf5 w D8 FORM (choć nie było to statystycznie istotne). Wydaje się więc, że ekspresja miR-206 reaguje na wiele kolejnych dni stymulacji formoterolem, a ten wzrost ekspresji miR-206 może być związany z aktywnością miogenną w mięśniach szkieletowych, jednak potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić ten związek.

Obserwacje dla Myf5 mogą być również wyjaśnione przez ekspresję B2AR w odpowiedzi na ostrą i kolejne dni stymulacji formoterolem. B2AR służy jako główny receptor dla formoterolu, umożliwiając jego działanie wewnątrzkomórkowe. Obecnie wzorce ekspresji B2AR w D6 FORM, D7 FORM i D8 FORM były podobne do tych obserwowanych dla Myf5, MyoD i Miogeniny. Ekspresja B2AR jest zauważalnie podwyższona w D6 FORM w porównaniu do D7 FORM i D8 FORM, choć nie osiągnęło to istotności statystycznej. Na tej podstawie teoretyzujemy, że po pierwszym dniu stymulacji formoterolem mogła nastąpić desensytyzacja poprzez wiązanie agonista-receptor, minimalizując późniejsze efekty wewnątrzkomórkowe obserwowane w D7 FORM i D8 FORM.

Jak przebiegała metodologia badania i jakie są implikacje wyników?

W badaniu zbadano również wpływ formoterolu na regulatory masy i wzrostu mięśni szkieletowych. Wzrost mięśni szkieletowych jest regulowany przez złożoną i wzajemnie powiązaną sieć bodźców mechanicznych, hormonalnych i chemicznych. Centralny dla tego jest mTOR ze względu na jego regulację syntezy białek. Kilka badań na modelach zwierzęcych wykazało, że formoterol może indukować ekspresję mTOR, a osiąga się to prawdopodobnie poprzez aktywację szlaku PI3K/Akt przez formoterol. Zaobserwowano zmniejszenie ekspresji mTOR w D6 FORM i D8 FORM, co sugeruje, że ostra i kolejne dni stymulacji formoterolem mogą hamować molekularną regulację wzrostu mięśni szkieletowych.

Obserwacje dla mTOR mogą być wyjaśnione przez wzrost ekspresji miR-206. Pomimo wpływu miR-206 na miogenezę, wydaje się, że ma on hamującą rolę w wzroście mięśni szkieletowych, celując w Akt i insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1), które są zaangażowane w aktywację mTOR. W ten sposób, zwiększając ekspresję miR-206, zarówno ostra, jak i kolejne dni stymulacji formoterolem mogły osłabić ekspresję mTOR. Oprócz miR-206, zmierzono również ekspresję miR-486, który wydaje się pośrednio promować wzrost mięśni szkieletowych poprzez hamowanie homologu fosfatazy i tensyny (PTEN), a także celowanie w FoxO1 i FoxO3. Mimo to, nie zaobserwowano żadnych istotnych zmian w ekspresji miR-486 zarówno przy ostrej, jak i kolejnych dniach stymulacji formoterolem. Warto wspomnieć, że chociaż ustalono mechanistyczny związek między receptorem beta-2 adrenergicznym a szlakiem sygnałowym PI3K-Akt-mTOR, obserwacje dla ekspresji mTOR w odpowiedzi na stymulację formoterolem odzwierciedlają wcześniejsze wyniki z laboratorium.

Obserwacje dla mTOR mogą być również wyjaśnione przez wyniki dla PGC-1α, FoxO3 i MAFbx. Wcześniejsze badania wykazały, że formoterol jest silnym stymulatorem ekspresji PGC1α w mioblastach mięśni szkieletowych. W badaniu zaobserwowano znaczący wzrost ekspresji PGC-1α w D6 FORM, co sugeruje, że ostra stymulacja formoterolem mogła preferencyjnie przesunąć aktywność komórkową i molekularną w kierunku stanu metabolicznie wymagającego, minimalizując potencjalny wpływ, jaki formoterol mógłby mieć na regulatory wzrostu mięśni szkieletowych. Dodatkowo zaobserwowano wzrost ekspresji FoxO3 i MAFbx w D6 FORM, choć żaden z nich nie był statystycznie istotny w porównaniu z innymi grupami. Biorąc pod uwagę wzrost ekspresji PGC-1α w D6 FORM, obserwacje dla FoxO3 i MAFbx mogły być konsekwencją potencjalnych efektów formoterolu w przesunięciu aktywności komórkowej i molekularnej do regulacji metabolicznej.

Jednakże zaobserwowano zmniejszenie ekspresji MuRF1 w D7 FORM, co sugeruje, że poza ostrą stymulacją ćwiczeniami, kolejne dni stymulacji formoterolem mogą osłabiać degradację białek mięśniowych. Mechanizmy wyjaśniające te potencjalne interakcje między ostrą a kolejnymi dniami stymulacji formoterolem a czynnikami zaangażowanymi we wzrost mięśni szkieletowych i degradację białek mięśniowych są nieznane i wymagają dalszych badań. Dodatkowo, uzasadnione są badania eksplorujące ekspresję genów związanych z metaboliczną i tlenową wydolnością komórek mięśni szkieletowych (np. AMPK) w odniesieniu do wyników dla PGC-1α, aby dalej wyjaśnić obserwacje w tym badaniu.

Metodologia badania obejmowała hodowlę pierwotnych ludzkich mioblastów mięśni szkieletowych uzyskanych od zdrowych dorosłych dawców. Komórki były hodowane w 35 mm 6-dołkowych płytkach pokrytych kolagenem w 37°C w 5% CO₂ w medium wzrostowym dla komórek mięśni szkieletowych. Mioblasty (n = 5) były wysiewane z gęstością 80 000 komórek na dołek. Przy konfluencji (80-90%), medium różnicujące było używane do inicjacji formowania miotub. Medium różnicujące było wymieniane co 48 godzin, a różnicowanie osiągano w ciągu ~6 dni. Jako mimetyk ćwiczeń zastosowano fumaran dihydratu formoterolu o czystości >98% HPLC, rekonstytuowany w dimetylosulfotlenku (DMSO) i zmieszany z medium różnicującym w stężeniu 30 nM. DMSO używano jako kontrolę, dodając objętość równą formoterolowi do medium różnicującego dla grupy kontrolnej w tym badaniu.

W badaniu wykorzystano trzy warunki eksperymentalne: (a) kontrola (CON), (b) ostra stymulacja formoterolem (AFS) i (c) kolejne dni stymulacji formoterolem (CFS). Dla AFS, dojrzałe miotuby były traktowane 30 nM formoterolu przez trzy godziny w dniu 6 różnicowania (D6), po czym natychmiast następowała ekstrakcja RNA. Podobnie, dla CFS, dojrzałe miotuby były traktowane 30 nM formoterolu przez trzy godziny przez dwa (D7) lub trzy kolejne dni (D8). RNA było ekstrahowane natychmiast po końcowej trzygodzinnej obróbce formoterolem dla D7 i D8.

Podsumowując, wyniki badania wskazują, że formoterol wpływa na ekspresję genów regulujących miogenezę i wzrost mięśni szkieletowych. Ostra stymulacja formoterolem promuje miogenezę, zwiększając ekspresję Myf5, ale efekt ten zanika przy kolejnych dniach stymulacji. Dodatkowo zaobserwowano zwiększoną ekspresję genów zaangażowanych w aktywność metaboliczną i mitochondrialną, a także degradację białek mięśniowych w odpowiedzi na ostrą stymulację formoterolem. Efekty te nie były już obserwowane przy kolejnych dniach stymulacji formoterolem, a co ciekawe, ekspresja genów reprezentatywnych dla syntezy białek mięśniowych została zmniejszona zarówno przy ostrej, jak i kolejnych dniach stymulacji formoterolem.

Łącznie wyniki tego badania dostarczają interesujących ram dla połączonej sieci między miRNA a genami regulującymi miogenezę i wzrost mięśni szkieletowych w odpowiedzi na stymulację ćwiczeniami. Potrzebne są dodatkowe badania in vitro i in vivo zajmujące się tym związkiem oraz niuansami między ostrymi a długoterminowymi ćwiczeniami na te procesy, aby bardziej szczegółowo scharakteryzować znaczenie miRNA dla fizjologii mięśni szkieletowych.

Podsumowanie

Badanie przeprowadzone na modelu in vitro ludzkich komórek mięśni szkieletowych wykazało, że formoterol ma złożony wpływ na procesy miogenezy i regeneracji mięśni. Ostra stymulacja formoterolem prowadzi do zwiększenia ekspresji Myf5, kluczowego czynnika w procesie miogenezy, jednak efekt ten słabnie przy długotrwałej stymulacji. Zaobserwowano również wzrost ekspresji miR-206, szczególnie widoczny przy wielodniowej stymulacji, co może wpływać na regulację wzrostu mięśni. Formoterol oddziałuje także na ekspresję PGC-1α, głównego regulatora biogenezy mitochondrialnej, oraz na szlak mTOR odpowiedzialny za syntezę białek. Wyniki wskazują na potencjalne zastosowanie formoterolu jako mimetyku ćwiczeń, jednak jego długotrwałe stosowanie może prowadzić do zmniejszenia efektywności poprzez desensytyzację receptorów β2-adrenergicznych. Badanie dostarcza istotnych informacji o molekularnych mechanizmach działania formoterolu, co może mieć znaczenie w terapii schorzeń mięśniowych.